纤维蛋白凝胶包埋下多孔支架上人真皮成纤维细胞的生物学特性

【摘要】背景：组织工程支架给予细胞提供力学支撑、生长空间、化学及生物学刺激，引导细胞沿特定器官组织内部构型生长，以便合成具有特定功能的器官组织，因此支架的设计至关重要。本实验主要研究体内共培养及体外共培养下细胞在不同孔径支架上的形态学特性及体内培养情况支架孔径的不同对细胞长入支架的影响。第一部分纤维蛋白凝胶的包埋对不同孔径支架上人真皮成纤维细胞形态学的影响目的研究模拟体内共培养与体外共培养对不同孔径支架上细胞生物学特性的影响。方法实验组：在自制正面观模型F及侧面观模型L中，将分离纯化的人真皮成纤维细胞分别和5种不同孔径（600、400、270、170、100um）的镍网共培养，并用纤维蛋白凝胶将其包埋来模拟细胞支架体内共培养。对照组：方法和实验组相同，但无纤维蛋白凝胶的包埋。倒置相差显微镜被用来观察人真皮成纤维细胞在镍网的生长方式。用鬼笔环肽将两组中细胞染色，并用共聚焦荧光显微镜观察两组中人真皮成纤维细胞中微丝骨架的排列。结果在实验组，无论镍网孔径的大小，人真皮成纤维细胞的主要生长方式为沿边叠层生长，即细胞首先沿着网孔生长，然后随着细胞的增殖，开始叠层排列，并继续按镍网构架生长；同时有部分细胞脱离支架长入周围的纤维蛋白凝胶中。在对照组，随着支架的孔径的变小，细胞的主要生长方式由沿边叠层生长逐渐转变为架桥生长，即细胞整个悬空，只有两端和支架相连；同时并无细胞脱离支架生长。结论体外培养情况下，随着支架孔径的变小，细胞的生长形态为沿支架构型生长向跨桥生长转变。模拟体内培养情况下，细胞的生长形态并不随支架孔径的变化而变化，而主要沿支架构型生长。第二部分纤维蛋白凝胶包埋下的孔径的不同对成纤维细胞长入多孔立体支架的影响目的通过纤维蛋白凝胶对支架的包埋来研究模拟体内培养下不同孔径多孔立体支架对成纤维细胞生物学特性的影响。方法应用镍网及聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作不同孔径的多孔立体支架；纯化培养成纤维细胞并种植于支架的周围，并用纤维蛋白凝胶包埋，根据镍网孔径设置实验组及空白对照组。给予细胞DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色及鬼笔环肽染色,并用倒置相差显微镜及共聚焦显微镜下观察，记录细胞迁延长度并绘制细胞迁延曲线，记录细胞穿网后细胞数目并对比。结果形态学观察：大部分成纤维细胞以触足的形式和支架接触，然后细胞及其内部的微丝骨架按照支架的构型生长排列，当细胞的增殖到一定的程度后开始出现大量穿孔现象；少部分的成纤维细胞可直接穿过支架上的孔隙。DAPI染色示：各组细胞核形态正常，核质均染，未见明显凋亡及坏死细胞。细胞迁延曲线示：实验组中细胞迁延速度大于对照组，不同孔径多孔立体支架内细胞迁延速度相差不大；当细胞遇到镍网后细胞迁延会出现阻滞，呈现为平台期。不同孔径支架细胞穿网数目比较无统计学意义（P>0.05）。结论模拟体内培养的情况下，细胞会首先依附到支架上生长，而不是直接穿孔长入支架，当细胞的数目增殖到一定程度时便会脱离支架，出现穿孔现象。细胞在三维多孔支架上内穿行的速度和支架孔径的大小无关，而和细胞在支架上迁延的速度及细胞增殖的速度相关。
【作者】陈道东；
【导师】沈忆新；
【作者基本信息】苏州大学，骨科，2014，硕士
【关键词】组织工程；支架；纤维蛋白凝胶；成纤维细胞；

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